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  动物的原生质体培育_生物学_天然科学_专业材料。动物的原生质体培育

  动物的原生质体培育 次要内容 ?原生质体的概念 ?原生质体培育的优胜性 ?原生质体的分手 ?原生质体的培育 原生质体(protoplast): 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包 围的裸露球形细胞。 细 胞 动物细胞模式图 高尔基体 微丝 叶绿体 线粒体 质膜 液泡 细胞核 内质网 微管 细胞壁 细胞壁由三种次要成分形成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5% 一、动物原生质体的特点: 1、接收能力加强:易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、 病毒等;易于接收氧、养分; 2、具有万能性:具有全套的遗传物质,具有细胞壁再生并 能进行人工培育分化发育成完整植株的能力; 3、在必然前提下可诱导原生质体融合,构成杂种细胞 。 4、排泄能力提高: 去除了细胞壁的扩散妨碍,使细胞膜的透 过性加强,利于胞内产品的排泄。 5、不变性较差: 得到了细胞壁的庇护感化,不变性较差,易 于遭到渗入压等前提变化的影响。 原生质体用处 消息传送、能量转换 细胞壁合成机理 膜的布局与功能 融合发生体细胞杂种 分手各类细胞器 引入各类细胞器 核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的彼此感化 动物激素的感化机理 导入外源基因 诱发突变体 原生质体培育的意义 (1)为细胞融合奠基根本。有性杂交不克不及进行细胞 质交换。 (2)是遗传工程的抱负受体。可以或许间接摄取外源 DNA,细胞器以至微生物。 (3)理论研究。细胞壁再生、细胞膜离子转运、病 毒侵染。 由于细胞壁不只具有庇护功能,还参与细胞的生 长和分化等生命勾当。可是必需指出:原生质体必需 再生出细胞壁才能继续发育。 二、 原生质体的制备 分歧的动物细胞,因为细胞壁的构成、结 构和性质有所分歧,原生质体的制备方式也不 一样。 1、用于分手原生质体的材料预备:拔取发展兴旺 的细胞,幼嫩的组织。 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培育细胞(愈伤组织) 2、原生质体的分手 1)、机械法:芒刃机械切割 2)、酶解法:果胶酶和纤维素酶处置 1)机械法 ? 1892年起首用于藻类分手原生质体 ? 做法:先使细胞质壁分手,再用刀把细胞壁 切破,使原生质体流出或释放出来。 ? 长处:该方式可避免酶制 剂对原生质体的粉碎感化。 ? 错误谬误: 1) 手工操为难度大,原 生质体得率低,费时吃力, 难以大量制备。 2)可以或许用此法发生原生 质体的动物品种遭到限制。 2)酶解法 ? 1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番 茄幼苗根尖中大量制备出原生质体; ? 常用酶:纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗 牛酶等; ? 长处:前提暖和、原生质体完整性好、活力 高、得率高,并且几乎所有的动物或它们的器 官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 ? 错误谬误:酶制剂中均含有核酸酶、卵白酶、过 氧化物酶以及酚类物质,影响所获原生质体的 活力。 ?酶解制备原生质体过程 ? 1)、取材预处置 ? 2)、酶解制备 ? 3)、原生质体收集 1)材料预处置 (暗处置,预培育和低温处置) 在酶处置前,常把供体组织置于合适浓度的稳压 液中,使细胞预质壁分手约一小时后再用酶液处置。 缘由:预质壁分手可使胞壁内表层充实表露,增 加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度; 降低原生质体内电解质渗漏,防止在分手期间外来酶 被吸入细胞内,降低原生质体对酶液中可能具有的有 害影响的敏感,提高原生质体的不变性和存活率。 2)酶解考虑要素 A、酶溶剂及其渗入压 ?酶的品种 ?酶溶剂:原生质体培育基或特殊配制、PH値。 ?渗入压调理剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 B、酶解时间:酶浓度及温度。 酶的品种和浓度 ?纤维素酶(Cellulase) Onozuka R-10 ?果胶酶(Pectolyase)Y-23 ?半纤维素酶(Hemicellulase) 对幼叶来说,酶浓度较低:0.5%-1%纤维素酶, 果胶酶(0.2%-0.5%); 酶量少 对愈伤组织、悬浮细胞:纤维素酶、果胶酶的浓 度要提高到1%或2%。酶量大 酶液PH值:5.4-5.8,由于PH高,酶活性 低;PH低,原生质体损坏多。 酶液渗入压 裸露的原生质体必需维持在必然的渗入压下, 才既不涨破,又不因过度收缩而粉碎内部布局。 因而在酶液中须插手渗入压不变剂来取代细胞壁 对原生质体起庇护感化。 常用的渗入压不变剂是糖醇系统,包罗甘露 醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大大都使 用甘露醇或山梨醇,它们能不变地维持渗入浓度。 浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质 体接收操纵,降低渗入浓度,故不常用。 酶解处置的前提 光:一般暗中下静止进行; 温度:25℃,兼顾原生质体及酶活性; 时间:几小时到几十小时,太长晦气于原生质体 的活性,一般24小时。如烟草叶片酶处置2小时 后叶肉细胞解离完毕。 其它 酶液中插手葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类 庇护细胞膜、提高原生质体不变性和活力 3)原生质体分手过程:一步法 (以烟草叶片为例) ? 第一步:预处置即对烟草植株限制供水 ? 第二步:取幼叶常规概况消毒后在无菌前提下剥 去外表皮切成4cm的小块 ? 第三步:制造夹杂酶液(纤维素酶2%和果胶酶 0.5 % )并插手的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6 ? 第四步:将小块烟叶放入夹杂酶液25 ℃处置 8~10小时 ? 第五步:过滤、离心、洗涤( 0.7 mol甘露醇液 含0.1 m mol CaCl2 )。如斯2~3次、得原生质 体 图示原生质体分手过程(以叶片为例) 加果胶酶 和纤维素酶 过滤、离心 以愈伤组 织为材料分手 原生质体。 以叶片为 材料分手原生 质体。 3、原生质体的收集和纯化: 酶解处置后获得夹杂液包罗原生质体、细胞团和组织碎 片等,必需将杂质和酶液除去,才能够继续培育。 原生质体纯化方式有:离心沉淀法,漂浮法,接口法。 1)离心沉淀法 筛网过滤(400目)除去未消化的细胞、细胞 团和碎片后在恰当试剂(甘露醇)内低速离心。 ? 优错误谬误: ? 比力简单 ? 但不易除尽一些完整的细胞,或惹起原生质 的破裂 2)飘浮法 据原生质体比重小能在必然渗入压的溶液(如 25%的蔗糖)中漂浮获得收集。 优错误谬误: ? 能够获得较为纯净、完整的原生质体。 ? 但无缺的原生质体数量较少。 3)沉淀法和飘浮法连系 先沉淀后漂浮,反复操作,纯化后可用于培育或 细胞融合。 4)接口法(界面法) 采用两种比重分歧的溶液,使原生 质体处于两液相的界面之中,此中一种 溶液的密度大于原生质体的密度,另一 种溶液的密度小于原生质体的密度,原 生质体介于两种溶液之间。 优错误谬误: 能够收到数量较大的纯净原生质体, 同时避免收集过程华夏生质体因彼此挤 压而破裂。 13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液 以柑桔为例 原生质体分手纯化流程图 4、原生质体判定 ?目标:查验获得的原生质体能否真正的原生质体 ?判定方式(针对有无细胞壁): ?低渗爆破法: 原生质体在低渗溶液中吸水胀破,察看有无细 胞壁碎片; ?荧光染色法: 通过荧光增白剂染色后离心去除多余染料,在荧 鲜明微镜下察看(波长3600-4400?),绿鲜明示有 纤维素,红光示线、原生质体活力检测 ?染色法 ? FDA法:FDA(二乙酸荧光素)能穿越细胞质膜, 被活细胞内的酯酶裂解,在荧鲜明微镜下发荧光(荧 光素)。 ?伊凡蓝法:伊凡蓝不克不及穿过质膜,但质膜遭到严峻 损坏使细胞被染色。 ?胞质环流法:能否具有胞质环流判断原生 质体活力; ?渗入压变化法:活原生质体味跟着外界渗入压的变化 体积变化。 ?氧电极法:活原生质体在光照下光合放氧,无光呼吸 耗氧。 6、影响原生质体活力的要素 ? 分手材料的心理形态; ? 酶解前提:酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、 酶溶液的渗入压; ? 分手前提:离心次数、离心速度、纯化方式、分手 持续时间; ? 情况前提:操作情况的温度、分手器具的影响。 二、原生质体的培育 (一)培育基 1.渗入压:原生质体的渗入压准绳是培育基渗入压与细胞渗入 压等渗。常用的渗入压调理剂:甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡 萄糖等。 2.无机盐 3.无机成分:维生素、氨基酸、糖及糖醇等,酵母提取物、水 解酪卵白。 4.激素:常用的激素:NAA、IAA、BA与2,4-D 5.pH值 (二)原生质体培育方式 ?液体浅层培育 ?固体培育 ?液体-固体双层培育 ?琼脂糖珠培育 (三)影响原生质体培育的次要要素 ?基因型:如番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分手的遗传分 析,证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定; ?原生质体的来历:供体材料体类型、供体细胞的分化程度、 供体细胞的发展同步性; ?起始培育密度与培育基:根基起始密度、培育基激素程度、 密度与培育基养分成分完全性。 三、原生质体的发育和植株再生 动物组织 去壁 原生质体 动物细胞 ? ? 愈伤组织 植株再生 完整细胞 ? 胚状体 一般包罗如下几个步调: 1)细胞壁再生: 体积膨大,叶绿体从头陈列,新的细胞 壁起头合成,细胞由球形变成卵形。 2)割裂: 一般在培育2-3天后细胞质 添加,细胞器增殖,DNA、 卵白质等合成添加,现金彩票平台细胞分 裂,构成小的细胞团,发育 成愈伤组织或胚状体。 3)植株再生 第二次割裂 第一次割裂 多细胞团 第三次割裂 肉眼可见细胞团 愈伤组织 愈伤组织 器官发活路子 胚胎发活路子 植株 动物原生质体培育的使用 1、操纵原生质体融合获得融合细胞 2、操纵原生质体进行外源基因的转化 3、操纵原生质体再生植株 4、操纵固定化原生质体培摄生产次级代谢产品 较多的排泄产品 5、操纵原生质体进行生物转化 通过原生质体中具有的酶或酶系的催化作 用,将酶感化的底物转化为所需的产品,提高 转化效率 四、原生质体研究的趋向 ? 1、低密度和单个原生质体培育; ? 2、单倍配子体如花粉原生质体培育; ? 3、计较机节制系统、流式细胞光度计 等手艺的使用。

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