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  第7章 原生质体培育和体细胞杂交_理学_高档教育_教育专区。组织培育

  动物组织培育 第7章 原生质体培育与 体细胞杂交 Good Morning 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 本章次要内容(3学时) 原生质体的分手与纯化 原生质体培育 原生质体融合 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 本章讲授目标与要求 (1)领会原生质体培育的意义; (2)控制原生质体分手的大致步调; (3)控制原生质体培育的方式; (4)控制原生质体融合的方凑。 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 原生质体(Protoplast) ? 寄义:去掉细胞壁的由质膜包裹、 具有糊口力的裸露细胞。 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 动物细胞模式图 高尔基体 微丝 叶绿体 线粒体 质膜 液泡 细胞核 内质网 微管 细胞壁 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 第一节、原生质体分手及纯化 ? 一、原生质体分手 双子叶外植体 胚性细胞 第一节、原生质体分手 及纯化 (一)材料来历 ? 大都动物分手原生质体的典范材料----叶肉细胞。 禾本科动物: 愈伤组织或悬浮细胞。 ? 第一节、原生质体分手 及纯化 (二) 分手方式 机械分手法 酶法分手法 第一节、原生质体分手 及纯化 1、机械分手法(Machanical isolation) 长处: (1)能解除酶的无害影响; 错误谬误: (1)原生质体的产量低; (2)方式繁琐吃力; (3)局限性大 第一节、原生质体分手 及纯化 2、酶法分手(Enzymatic isolation) (1)酶的品种 ?纤维素酶类(Cellulase) ?果胶酶类(Pectolyase) ?半纤维素酶类(Hemicellulase) ?解体酶 ?蜗牛酶 第一节、原生质体分手 及纯化 (2)酶液的配制 酶的配等到浓 度 渗入压不变剂 及pH 第一节、原生质体分手 及纯化 (3)分手原生质体 方式有二: 两步分手法 一步分手法 叶肉原生质体分手提纯 第一节、原生质体分手 及纯化 图示原生质体分手过程(以叶片为例) 加果胶酶 和纤维素酶 过滤、离心 第一节、原生质体分手 及纯化 叶片 愈伤组织 第一节、原生质体分手 及纯化 二、 原生质体纯化与活力测定 (一)原生质体纯化 方式三种 离心沉淀法 漂浮法 界面法 第一节、原生质体分手 及纯化 1、 离心沉淀法 ? ? ? ? ? ? 道理:使用原生质体的比严重于溶液,离心后原 生质体沉于底部。 步调: 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心(500-1000r/min,离心5-6min)。 第三步吸去上清液,洗涤液从头悬浮,再离心沉 淀。如斯2-3次。 第四步用原生质体培育液洗1次,收集原生质体。 第一节、原生质体分手 及纯化 2、漂浮法 ? ? ? ? ? ? 道理:使用渗入剂含量较高的洗涤液使原生质体 漂浮在液体的概况。 步调: 第一步:400目网筛过滤。 第二步:离心。 第三步:吸去上清液,洗涤液重悬,离心沉淀。 2-3次。 第四步:收集溶液概况原生质体,用培育液洗 1 次。 第一节、原生质体分手 及纯化 3 、 界面法 道理:选两种分歧渗入浓度的溶液,其 中一种溶液密度大于原生质体的密度, 另一种溶液小于原生质体的密度。 13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液 第一节、原生质体分手 及纯化 (二) 原生质体活力测定 1、形态识别:形态上完整,呈圆形,含有丰满的 细胞质,颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 ? 1)0.1%酚番红或Evans蓝染色:有活力的不被 染色,灭亡的被染上色。 ? 2)双醋酸盐荧光素(FDA)染色法:在荧鲜明微 镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 第二节 原生质体培育 一、培育基 碳源 pH 培育基 氮源 渗入压 钙镁 发展物质 第二节、原生质体培育 二、培育方式 培育方式 液体浅层培育 平板培育法 双层培育法 豢养层培育法 第二节、原生质体培育 1、液体浅层培育 原生质体 悬浮液 2x105/ml 1mm厚液体培育基 第二节、原生质体培育 2、平板培育 原生质体纯化、离心、稀释后,再与1.4% 琼脂或琼脂糖(37?C摆布)等体积夹杂成0.7% , 培育于培育皿中。 第二节、原生质体培育 3、双层培育法(固、液培育) 培育皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固 体培育基,在其长进行原生质体浅层培 养。 固体培育基 第二节、原生质体培育 4、豢养层培育 方式一:X-射线杀死原生质体,与糊口 力一般的原生质体夹杂,插手0.7%琼脂, 制成夹杂液,培育于培育皿中。 第二节、原生质体培育 4、2018彩票合买网豢养层培育 方式二:X-射线%琼 脂夹杂,在培育皿中铺成平板,作为豢养 层,再将糊口力一般的原生质体与0.7%琼 脂夹杂,培育于豢养层上。 第二节、原生质体培育 原生质体的割裂 第一次割裂 第二次割裂 第三次割裂 多细胞团 第二节、原生质体培育 植株再活路子 肉眼可见细胞团 愈伤组织 植株 器官发活路子 胚胎发活路子 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 第三节、原生质体融合 定义:原生质体融合也叫做体细胞杂交, 使分手出来的分歧乡本的原生质体,在人 工节制前提下,彼此融合成一体,构成杂 种细胞,并进一步发育成杂种植株的手艺。 第三节、原生质体融合 一、原生质体融合意义 —降服杂交不亲合 —降服生殖器官败育 —降服柑桔多胚 第三节、原生质体融合 番茄+马铃薯 第三节、原生质体融合 二、融合方式 无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG连系高钙-高pH诱导法 电融合手艺 第三节、原生质体融合 (一)无机盐诱导融合: NaNO3法 ? 1972年: Carlson诱导原生质体融合获得 首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞 杂种。 NaNO3的感化:中和质膜的负电荷,使原 生质体不再彼此排斥,而慎密连系在一路 不足:诱导频次不高。 第三节、原生质体融合 (二)高pH-高Ca离子法 1973年:Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶 液在37℃时,诱发烟草叶肉原 生质体融合。 长处:杂种产量高。 不足:高pH值对细胞有迫害感化。 第三节、原生质体融合 Polyethylene Glycol(聚乙二醇) (三)PEG法 PEG法特点: 融合频次高 可反复性强 诱发融合无特同性 毒性较低 动物+动物 动物+动物 动物+酵母 第三节、原生质体融合 PEG法道理 PEG是一种带负电性的高分子化合物,在 原生质体融合中起到一种桥梁感化,能够使原 生质体凝结。在洗脱过程中, PEG 将被洗掉, 导致质膜概况电荷重排。粘连的质膜大面积紧 密相连,电荷的重列队导致一个原生质体的负 性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相 连而导致融合。 第三节、原生质体融合 PEG法示企图 -+ 桥梁 - + - -+ + - PEG被洗掉 + - +- + - +- 膜接触 电荷重排 第三节、原生质体融合 (四)PEG连系高钙-高pH诱导法 最为常用。 具体做法:在无菌前提下夹杂双亲原生质 体----滴加PEG溶液,摇匀,静置---滴加 高钙-高pH溶液,摇匀,静置---滴加原生 质体培育液洗涤数次---离心获得原生质 体细胞团---筛选---再生杂合细胞 第三节、原生质体融合 (五)电融合手艺 Senda 1979年起首用此方式实现原生 质体融合 细胞融合仪 第三节、原生质体融合 电融合法道理 交换电场使原生质体概况电荷偶极 化,沿着电极陈列,构成串珠。 - + + + 负极 + - + - - + + 正极 + + - 第三节、原生质体融合 施加直流电场后,构成串珠的原生质体在质 膜接触处发生穿孔,起头遗传物质的交换。 + + + + - + + - + + - 第三节、原生质体融合 原生质体的融合过程: 第三节、原生质体融合 三、体细胞杂种细胞筛选与判定 1.互补选择法 2、机械分手杂种细胞法 3. 双荧光标识表记标帜选择法 第三节、原生质体融合 3. 双荧光标识表记标帜选择法 异硫氰酸荧光素(FITC):绿色 异硫氰酸罗丹明(RITC):红色 第三节、原生质体融合 第三节、原生质体融合 四、体细胞杂种植株的判定 形态学判定 细胞学察看 DNA内切图谱阐发 同工酶阐发 第三节、原生质体融合 4-1、形态学判定 第三节、原生质体融合 4-2、细胞学察看 染色体形态和数目标比力 18条染色体 36条染色体 第三节、原生质体融合 4-3、 DNA内切图谱阐发 RAPD带型 (随机扩增的多态性DNA) 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 本章小结: (1) 原生质体培育的意义:(1)再生植株; (2)用于远缘 体细胞融合,进行体细胞杂交。 (2) 原生质体分手方式:机械分手法、酶法分手。 (3)酶的品种及特点 (4)原生质体的纯化方式:离心沉淀法;漂浮法;界面 法。 (5)原生质体活力的测定:形态识别;染色识别。 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 本章小结: (6)原生质体培育方式:液体浅层培育;平板法培育; 悬滴法培育;双层培育法;饲喂层培育 (7)原生质体融合的方式:无机盐诱导融合;聚乙二醇 与高pH高钙相连系的诱导融合;电融合手艺。 (8)杂种细胞的筛选与判定:互补选择;机械分手杂种 细胞法;双荧光标识表记标帜选择法 (9)杂种植株的判定:形态学判定;细胞学察看; DNA内切图谱阐发;同工酶阐发 第7章 原生质体培育 与和体细胞杂交 兰花

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