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  原生质体培育尝试_生物学_天然科学_专业材料。烟草原生质体的培育尝试,简单了然

  尝试五 原生质体培育 一、尝试目标与意义 进修原生质体系体例备和培育的方式。 原生质体分手纯化后,在恰当的培育基上使用 合适的培育方式,可以或许再生细胞壁,并启动细胞 持续割裂,直至构成细胞团、长成愈伤组织或胚 状体、分化和发育成苗,最终再生成完整植株。 二、尝试器材 超净工作台、震动摇床、各类接种东西、微孔滤膜过滤器 三、尝试药品 MS培育基各类母液、NAA、6-BA、2,4-D、2-N-吗啉乙磺酸 (MES)、纤维素酶(Onozuka R-10,Japan)、解体酶 (Driselase)、果胶酶(Pectinase、Serva)、半纤维素酶 (Hemicellulase,Sigma)、离析酶(MacerozymeR-10)、 CaCl2.2H2O、KH2PO4.H2O、KN03 、MgS04.7H20 KI 、 CUS04.5H2O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂。 四、尝试步调 1、培育基及试剂的配制 ? 原生质体培育基:MS+2,4-D 0.5+NAA1+BA0.5+蔗糖250mg/L+葡萄 糖10000mg/L+(琼脂1.2%) ? CPW溶液:KH2P04 27.2 mg/L,KN03 101 mg/L,CaCl2.2H20 1480 mg/L,MgS04.7H20 240 mg/L, KI 0.16 m g/L,CuS04.5H20 0.025 mg/L,pH 5. 6)。 ? 质壁分手液CPW-13M的配制:含有13%甘露醇的CPW溶液 ? 细胞壁酶解液:2%(W/V)纤维素酶(cellulase Onzuka R-10) 、 1%(W/V) 半纤维素酶( hemicellulase H-2125, 0. 026 unit/m g)、0.5% (W/V)果胶酶 ( pectinase, 0.1 5 unit/m g)、0.5%离析酶(MacerozymeR-10)的CP W -9 M(含有9%甘露醇,5 mmol/L MES的CPW溶液,pH 5.2)液。 ? 洗涤液:含或不含250 μmol/L CaCl2,含5 mmol/L MES的9%甘露醇溶 液,pH 6.0。 2、酶解 拔取烟草愈伤组织1g置于小培育皿中插手1.5-3.0ml酶混 合液,轻摇匀封口,在来去式摇床(35-40 r/min, 25士1 ℃) 上黑暗酶解6-8 h。(材料和酶解液的体积大约1:10) 灭菌:过滤 3、纯化 用双层尼龙滤网(孔径64 um)过滤酶解液,滤液800rpm 离心10 min,弃去上清液。用少量CPW -9M消融沉淀, 小心插手盛有CPW-21S(含有21%蔗糖的CPW溶液,pH 5-6)溶液的离心管中, 800rpm离心5 min,溶液分为3层, 细心将漂浮在溶液中部的原生质体取出,经洗涤液洗涤2 次,离心,获得纯净的、具有心理活性的原生质体。 4、密度测定与调整 将原生质体消融在培育液中,用血细胞计数板记数。 5、培育 用融化的培育基将原生质体密度调整为5×105/mL,将其植板于培 养皿中,使成一薄层,凝固后,切成4个扇形块,插手液体培育基, 使扇形块漂浮此中,置于27士1℃暗中培育,培育7、14、21d,除去 旧液,插手新培育基(蔗糖含量为20mg/L,葡萄糖10g/L,其他成分 与MS不异。培育一周后能见到几个细胞以上的细胞团。继续培育细 胞团构成愈伤组织。腾讯分分彩最新漏洞 五、思虑题 原生质体系体例备与培育过程中要留意哪些问题?常用的原生质体培育 方式有哪些? ?烟草原生质体高效快速培育手艺: A、原生质体游离纯化:取培育30天的烟草无菌叶片, 放入酶解液中,酶解液经0.22μm夹杂纤维素微孔滤膜过滤 除菌,其pH5.8,酶解竣事,酶解液以900rpm离心7-8min, 去掉上清,向所得沉淀中慢慢插手6ml的CPW21盐溶液并 使沉淀悬浮,以800rpm离心6-7min,用巴斯德吸管小心地 将处于离心管上部的原生质体带吸出,并以CPW10溶液洗 涤2-3次后获得的原生质体即是纯净的原生质体; B、原生质体培育:将纯化的原生质体以0.5mlMS1培育基悄悄悬浮, 与等体积的MS2培育基夹杂平均,插手30mm×10mm培育皿,用Parafilm 膜封口后放入27℃恒温培育箱中倒置(防止水分蒸发)进行暗培育;此中将 MS根基培育基中的大量元素减半,获得1/2MS,插手了2.4-二氯苯氧乙酸 2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L,别的含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L;MS2为 1/2MS,插手6-苄基嘌呤0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸 0.5mg/L,别的含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L,培育10天后,获得细小愈伤 组织,间接将细小愈伤组织转入芽分化培育基,该培育基为MS,插手了噻 重氮苯基脲0.5mg/L和活性炭3g/L;培育20后,获得具4片叶的小苗,再将小 苗转入诱根培育基,该培育基与MS1不异,但不含任何激素,并且插手了 活性炭3g/L;诱根 10天摆布萌生4-5条不定根,即可进行移栽。

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