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  第九章++动物原生质体培育_理学_高档教育_教育专区。第九章 动物原生质体培育 与体细胞杂交 ? 原生质体培育的意义 第一节 原生质体的分手与纯化 第二节 影响原生质体产量和活力的要素 第三节 原生质体的培育 第四节 由原生质体再生植株 第五节 体细胞

  第九章 动物原生质体培育 与体细胞杂交 ? 原生质体培育的意义 第一节 原生质体的分手与纯化 第二节 影响原生质体产量和活力的要素 第三节 原生质体的培育 第四节 由原生质体再生植株 第五节 体细胞杂交 第六节 原生质体的使用价值 ? 原生质体培育的意义 1、原生质体的特征 (1)去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入 和接收。 (2)原生质体具有细胞万能性。 (3)分歧来历的原生质体具有相互融合的能力。 2、原生质体培育使用 (1)降服动物有性杂交的妨碍,扩大物种间遗传物 质交换的范畴,缔造有益变异,培育新品种。 (2)作为奇特的尝试系统,用于体细胞遗传、心理、 病理等方面的根本理论研究。 第一节 原生质体的分手与纯化 一、原生质体的分手 (一)分手原生质体的材料来历 (二)分手方式 1.机械分手法 2.酶法分手 (三)手艺法式 二、原生质体的纯化 (一)分手原生质体的材料来历 游离原生质体时,动物叶片、花瓣、果实组织、子叶、 下胚轴、幼根、茎叶、愈伤组织、悬浮细胞等都可作为材料 来历,但常用于分手原生质体的材料为: 1、叶片 叶片来历丰硕,供应及时,有较着的叶绿体存 在时也便于在细胞融合中识别。 2、试管苗的子叶、胚轴或茎尖等无菌材料 3、愈伤组织或悬浮培育细胞。 (二)分手原生质体的方式 1、机械分手法 2、酶法分手 酶法分手是操纵纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等酶类 降解细胞壁成分,获得原生质体的方式。 (1)分手原生质体的酶类 (2)酶解分手原生质体的方式 (3)酶解分手原生质体应留意的问题 ?按照动物材料品种选择所用酶的品种、处置浓 度、和处置时间。 ?酶解分手时应供给适宜的渗入压庇护,以防原 生质体分裂。 (1)分手原生质体的酶类 酶的类型 纤维素酶 感化 常用品种 半纤维素酶 果胶酶 降解细胞壁中纤维素成分, Onozuka R-10 游离原生质体。 Phozyme HP-150 降解细胞壁中的半纤维素 成分。 降解相邻细胞间的果胶质, Macerozyme R-10 使细胞游离。 (2)酶解分手原生质体的方式 ①两步分手法 这种分手方式是先用果胶酶离析动物组织,使 动物细胞从组织平分离出来,然后收集细胞经洗涤 后用纤维素酶解离细胞壁,最初获得原生质体。 ②一步分手法 即把必然量纤维素酶和果胶酶构成夹杂酶液, 对材料进行一次性处置,处置温度25~30℃,处置的 时间按照材料及酶浓度的分歧而分歧,可为2~24h。 (三)游离原生质体的手艺法式 1、材料预备:称重、灭菌与研碎。 2、预处置:研磨、切割、暗培育等。 3、酶解:插手酶液,保育处置; 4、收集纯化:过滤去除组织碎块;离心纯化原生质体。 5、活力检测 6、原生质体的培育 原生质体?再生细胞壁?细胞割裂,构成愈伤组 织?愈伤组织分化成苗 二、原生质体的纯化 (一)离心沉淀法 (过滤浓缩法) (二)接口法 选用两种分歧渗入浓度的溶液,此中一种溶液 的密度大于原生质体的密度,另一种溶液小于原生 质体的密度,原生质体经恰当速度离心后即介于两 种溶液之间。 (二)漂浮法 (一)离心沉淀法 1、方式:先将经酶处置的原生质体悬浮液用400目网筛过滤, 滤液经500~1 000r/min离心5~6min后,吸去上清液,然后 用一般洗涤液从头悬浮,离心沉淀,如斯反复2~3次。最初 再用原生质体培育液洗1次,收集原生质体备用。 2、留意: (1)整个过程用不异的渗入液,渗入压以稍高于原生质体内 渗入压,细胞稍微发生质壁分手为好。 (2)常用的原生质体清洗介质为CPW溶液; (3)这种方式简洁,但不克不及完全除尽少量脱壁不完全的细胞 和破裂的原生质体。 (二)接口法 1、方式: 先在离心管底插手山梨醇或蔗糖的浓溶液(21%),再小 心的插手过滤处置的酶-原生质体夹杂液,以合适的速度离心, 原生质体将堆积于两液面之间。小心取出原生质体转入另一 离心管,用清洗介质清洗、离心,反复3次。最初以恰当的密 度悬浮于液体培育基中。 2、好坏 该法可收集较纯的原生质体,且原生质体破裂较少。但 采用的高渗溶液往往对原生质体危险较大。 用此法的环节是节制好蔗糖或山梨醇的浓度及离心速度, 使原生质体漂浮于单一界面,且不影响原生质体的不变性和 活力。 第二节 影响原生质体产量 和活力的要素 一、材料来历 (一)动物叶片 (二)培育细胞 二、预处置 三、酶处置 四、渗入压 (一)动物叶片 当从动物叶片分手原生质体时,植株的发展环 境、植株春秋等对原生质体的分手和培育影响较大。 1、植株春秋 对一年生草本:发展40-60天的幼叶; 对多年生木本:幼龄且充实展开的叶片。 2、母株发展情况 母株发展在低光强(10001x)、短日照、温度 20℃~25℃、相对湿度60%~80%的前提下,以及较 高的氮肥供应。 3、采用离体苗叶片 (二)培育细胞 由培育细胞分手原生质体,其产量取决于培育细 胞的发展速度和发展期间。 屡次继代可推进细胞的兴旺割裂,发展期间以处 于对数发展晚期的细胞为好。即: 屡次继代(每2~3天继代1次)的悬浮培育物以及 处于对数发展晚期的细胞是最适宜的供体材料。 操纵培育细胞分手的原生质体往往容易实现细胞 壁的再生和细胞的割裂和分化。 分歧动物适宜于分手原生质体的材料 分歧科属的动物其材料特征具有差别,适宜于游离原生 质体的供体材料也异。 (1)茄科 一般选择发展兴旺、心理形态分歧的刚展开的幼嫩叶片。 (2)十字花科 种子萌生4-5天的无菌苗的下胚轴为材料,具有原生质体 得率高、活力强、再生频次高档长处。 (3)豆科 以未成熟种子的子叶为材料。 (4)禾本科 用幼胚、幼穗、花药或成熟胚为外植体成立胚性愈伤组 织及其胚性悬浮细胞系分手原生质体。 二、预处置 1、根据材料特征进行概况灭菌 2、促使酶液渗入组织细胞内的办法 (1)撕去叶片的下表皮,将无表皮的一面向下 漂浮在酶溶液中。 (2)将叶、胚轴、嫩茎等切成小块或薄片,投 入到酶溶液中。 (3)真空渗入促使酶液渗入。 (4)酶处置期间进行搅拌或振荡。 三、酶处置 1、原生质体分手在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ,因而要做好酶品种、处置浓度的选择。 2、酶处置的适宜前提 (1)pH值 酶的活性与pH相关,用于分手原 生质体的大大都酶适宜的PH为4.7-6.0 。 (2)温度 对用来分手原生质体的酶类来说, 最适温度是40~50℃,但分手原生质体时以25~30℃ 为宜。 (3)光照 凡是在暗中或在低光强下分手原生 质体。 1、酶品种、处置浓度、处置时间 (1)对于胚性愈伤组织、悬浮培育细胞 常用活性较强的酶的组合,如Cellulase RS、Pectolyase Y-23、Rhozyme HP150,而且酶处置浓度应高些,用量应大 些。 (2)对于叶片、子叶、下胚轴等材料 常用Cellulase R-10 、Macerozyme R-10、Hemicellulase 等活性属一般的酶,酶处置浓度可低些,用量少一些。 (3)酶解时间 视材料、酶性质、处置浓度而定,30min-24h。一般不 宜跨越24小时,免得游离的原生质体解体。 四、渗入压 离体原生质体的一个根基属性是它们的渗入破 碎性。所以在原生质体分手和最后培育阶段,应给 予渗入压庇护,以取代细胞壁对原生质体机械维持 的压力。 (一)渗入压庇护剂 (二)应留意的问题 (一)渗入压庇护剂 原生质体分手及培育过程中渗入压的调理凡是 操纵糖或糖醇来节制, 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖,此中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分手时最常用的为甘露醇(浓度为 0.23~0.90M)。 无效的渗入浓度决定于原生质体分手期间叶细 胞的渗入压。内源细胞渗入压较着地受情况前提的 影响,而且可以或许用暗处置植株和幼叶组织等办法加 以节制。 (二)应留意的问题 1、在酶处置液、原生质体清洗介质及原生质体 培育基中必需插手合适的渗入压庇护剂。 2、原生质体在轻细高渗溶液中比在等渗溶液中 不变。较高程度的渗入压虽可阻遏原生质体分裂, 但影响细胞的代谢、割裂和发展。 3、在分手原生质体时,能够利用电解质渗压剂, 但在原生质体培育时一般不消。 4、当用非电解质为渗压剂时,在酶液中插手某 些盐类,如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾,能够 提高质膜的不变性。 第三节 原生质体的培育 一、影响原生质体培育的要素 (一)根基培育基 (二)渗入压 (三)动物激素 (四)氮源 (五)复杂无机物 二、培育方式 三、培育密度 四、培育前提 (一)根基培育基 1、所利用的培育基一般是改良的细胞培育基,而且 培育基的根本成分多采用B5或MS培育基的配方。如 KM8P和K8P培育基: 以B5培育基为根本 NT培育基: 以MS培育基为根本 2、分歧动物常采用的培育基 禾本科动物: MS、N6、KM; 十字花科和豆科: B5、KM8P、K8P、KM; 茄科: MS、NT、K3 (二)渗入压 原生质体再生细胞壁之前,必需在培育过程中 供给适宜的渗入压庇护。 1、在原生质体培育中,一般常用的渗压剂有甘露醇、 山梨醇、蔗糖、葡萄糖及麦芽糖等。 2、在原生质体培育中不宜利用电解质渗压剂。 3、原生质体再生细胞壁后应使培育基的渗入压逐渐 降低。 (三)动物激素 1、分歧动物原生质体培育对激素的品种和浓度的要 求具有较大的差别。 2、发展素中常用的是2,4-D、NAA,在细胞割裂素 中最常用的是BAP、KT、2-IP。 3、在分歧的发展发育阶段(起始割裂、细胞团构成、 愈伤组织构成与器官分化、胚状体发生与成苗), 需要不竭对培育基中激素的品种和浓度进行当令调 整。 (1)在原生质体培育中,插手2,4-D对于原生质 体再生细胞壁,启动割裂,持续割裂直至构成愈伤 组织是很无效的,如禾谷类动物。 (2)一般细胞割裂素和发展素以必然配比连系 利用。 (3)由活跃发展的培育细胞分手的原生质体要 求较高的发展素/割裂素配比才能进行割裂; 由高度分化的细胞如叶肉细胞获得的原生质体, 常需要较高的割裂素/发展素配比才能进行脱分化。 (四)氮源 很多研究指出,恰当浓度的谷氨酰胺对原生质 体的细胞壁再生、细胞割裂和发展都有较着的感化。 NH4+浓度太高的培育基不宜用作原生质体培育 基。铵对很多动物(如烟草、马铃薯)的原生质体 有迫害感化,抑止原生质体的发展。降低培育基中 NH4+浓度对原生质体的存活、细胞再生及持续割裂 都有益。 还有良多尝试发觉硝酸盐对原生质体可发生毒 害感化,因而利用时应出格留意其用量。 (五)复杂无机物 在原生质体培育中,常插手一些复杂无机物, 能够分歧程度的提高再生细胞割裂频次,推进细胞 团的构成。 常用的无机物有谷氨酰氨、水解乳卵白、水解 酪卵白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。 二、培育方式 ?原生质体培育一般采用液体培育的方式,由于: (一)液体浅层培育 (二)平板法培育 (三)悬滴法培育 (四)固液连系培育法 原生质体培育一般采用液体培育 1、有些物种的原生质体不克不及在固体培育基上分 裂。 2、采用液体培育有益于调整培育基成分。 3、采用液体培育可将颠末几天高密度培育之后 的细胞密度降低,也可将感乐趣的细胞分手出来。 (一)液体浅层培育 1、方式 把原生质体以必然的密度(约2×105个/mL)悬浮在液体 浅层培育基中(浅层的厚度以1mm为宜),用白腊膜封住平 皿后,放在适宜前提下培育。 2、好坏 长处是:操作便利,对原生质体的危险也小;培育基 与空气接触面大、通气好;原生质体的代谢物易扩散,防止 了无害物质堆集过多而形成迫害;便于转移培育物或添加新 鲜培育基。 错误谬误是:原生质体分布不均,易形成局部密渡过高或 原生质体粘聚而影响其再生细胞的割裂和进一步的发展发育; 难以实施定点察看和跟踪察看。 (二)平板法培育 1、方式 取适量原生质体悬浮液,与热融并冷却至45℃的含琼脂或 琼脂糖的培育基等量夹杂,并敏捷悄悄摇动,使原生质体平均 分布。待凝固后,将培育容器置于四周垫有保湿材料的容器内。 2、好坏 ?有益于原生质体平均分布; ?便于定点察看,可跟踪察看单个原生质体的细胞壁再生、 割裂等行为; ?也有益于在部门材料污染时急救未污染的部门。 (三)悬滴法培育 1、方式 将适宜密度的原生质体悬浮液,用滴管或定量加液器, 以50ul/100ul的小滴接种于培育皿盖内,其数量以滴与滴间不 相碰为准绳,皿底插手液体以保湿。将皿盖稳妥地盖在皿底 上,封口培育。 2、好坏 长处是:所用材料较少,培育液用量也少;有益于通气 和察看, 易添加培育基;不易污染等。适合低密度培育。 错误谬误是:原生质体分布不均,易集中于小滴地方;液滴 与空气接触面大,培育基成分和物理特征易于变更。 (四)固液连系培育法 1、双层培育法 在培育皿底先铺一层固体培育基(含或不含原生质体/细 胞),再在其长进行原生质体的液体浅层培育。 2、切块悬浮培育 先将原生质体包埋于固体平板,再将其切成小块,投入 到大体积的液体培育基中,并放于摇床长进行振荡培育。 3、琼脂糖珠培育法 即将原生质体与琼脂糖培育基夹杂后,逐滴滴在培育皿 底面,待其凝固后,再在其四周插手液体培育基。采用这种 方式能够在液体培育基中插手经辐射处置的细胞。 三、培育密度 1、原生质体适宜的培育密度一般为1×1041×105个/ml,但这晦气于单细胞无性系的筛选。 2、低密度下培育原生质体,可通过改良培育基 构成和改良培育方式入手。 (1)一般培育基成分越复杂越全面,原生质体 的培育的植板密度就能够越低。 (2)改良培育方式也可无效降低培育密度。如 饲喂细胞层法;分歧类型的原生质体夹杂培育的方 法等。 四、培育前提 (一)光照 1、新分手出的原生质体应在散射光或暗中中培育。 2、在原生质体对光敏感的环境下,应尽量削减察看的 次数,凡经察看过的原生质体不该包罗在当前的尝试成果中。 (二)温度 1、原生质体培育一般在25-30 ℃下进行。 2、较高的培育温度往往有益于启动和维持原生质体的 割裂。 (三)湿度 在原生质体固体培育和小液滴培育中,应留意培育湿度 的连结。 第四节 由原生质体再生植株 一、原生质体再生细胞壁,构成完整细胞。 二、细胞割裂构成细胞团或愈伤组织。 三、由愈伤组织分化构成植株。 一、原生质体再生细胞壁 原生质体在培育中可否再生细胞壁并进行持续 的割裂是关系到原生质体培育成败的环节要素。 1、一般,原生质体再生细胞壁是其进行一般分 裂的前提。 2、新构成的细胞壁是由陈列松散的微纤丝构成 的,由这些微纤丝构成典型的细胞壁。 3、细胞壁的构成既受原生质体内在因子(如基 因型、原生质体来历)的节制,也受培育基构成等 外界要素的影响。 二、细胞割裂构成细胞团或愈伤组织 原生质体再生壁后起头第一次割裂的时间,随 动物品种、分手原生质体的材料、原生质体的质量、 培育基和培育前提而异。 并非所有再生细胞壁的原生质体都能进行割裂, 一般凡能割裂的原生质体,在颠末第一次割裂并持 续割裂后,将构成肉眼可见的愈伤组织。 第四节 体细胞杂交 一、体细胞杂交及一般步调 二、原生质体融合的一般过程 三、原生质体融合方式 (一)自觉融合 (二)诱发融合 四、原生质体融合产品的细胞学 五、杂种细胞选择 六、杂种植株判定 七、细胞质杂种 一、体细胞杂交及一般步调 1、体细胞杂交 指完全不颠末有性过程,通过体细胞融合获得杂种 细胞,再对杂种细胞培育使其分化构成杂种植株的过 程。 2、步调 原生质体系体例备?原生质体融合?杂种细胞选择?杂 种细胞培育?杂种植株再生?杂种植株判定 二、原生质体融合的一般过程 (一)包含了三个持续的次要阶段: 1、凝结感化; 2、细胞质桥的呈现; 3、细胞质桥的扩展和细胞的融合。 ? (二)留意 ? 操纵分歧品系的甜菜叶肉细胞进行电融合 图中下方的黑带是电极。 ? 原生质体的粘连并不必然必然导致膜的融合。 如伴刀卵白A或抗体都能促使原生质体的凝结, 但之后很少发生或不发生原生质体的融合。 ? 动物原生质体概况所带的电荷会阻遏原生质体的 粘连。 三、原生质体融合方式 (一)自觉融合 相邻的同种原生质体借助胞间连丝可发生融合,构成多 核的原生质体,这种不经外界要素诱导就发生的原生质体融 合称为自觉融合。 避免这种自觉融合:堵截胞间连丝。 (二)诱发融合 在外加要素诱导下的原生质体融合为诱发融合 1、化学融合法 2、电融合法 ?NaNO3处置:中和质膜概况负电荷,使之慎密结 合;诱导构成异核体的频次低,出格时原生质体来自于高 度液泡化的叶肉细胞时。 1、化学融合法 ?高pH-高浓度Ca2+处置 ?聚乙二醇(PEG)处置 ?聚乙二醇:为一种聚合化合物分子量在1500-6000之间, 易溶于水。 ?诱导特点 (1)构成的异核体频次较高,出格是双核异核体的比例 较高。 (2)PEG诱导原生质体融合没有特同性; (3)尝试可反复性很高。 (4)PEG对大大都细胞类型毒性低,适合于大大都物种 的原生质体融合。 ?诱导方式 1)收集原生质体; 2)将两种分歧来历的原生质体以恰当比例夹杂(如1:1), 静置使之沉降,添加触融机遇。 3)用28%-58%的PEG溶液处置15-30分钟,促使原生质体相 互粘连; 4)然后用清洗培育基逐渐清洗原生质体上的PEG,或用高 PH高浓度钙离子溶液清洗。 留意清洗应逐渐平缓进行,猛烈洗涤会削减异核体的构成。 5)融合体的培育。 ?诱导机制 四、原生质体融合产品的细胞学 ?间期核融合的成果并不发生有活力的杂种细胞,只要有丝 割裂期间的核融合构成的杂种细胞才能继续进一步的发育。 ?原生质体融合将发生以下杂种细胞: 1、亲合的细胞杂种: 具有双亲的全套染色体,并能进行一般割裂,构成异源双 倍体。 2、部门亲合的细胞杂种: 一个亲本的染色体组或全数消逝,或其染色体只要部门 的保留或重组于另一亲本的染色体组。 3、构成非整倍体的夹杂群体: 如粉蓝烟草(2N=24)和南氏烟草(2N=18)获得的体细 胞杂种,其染色体数处于56-64之间。 4、胞质杂种:包含一个亲本的染色体组,但包含双亲的细 胞质。 通俗小麦和簇毛麦体细胞杂交获得的杂种细胞染色体 (红色荧光者为通俗小麦染色体,黄色者为簇毛麦染色体) 五、杂种细胞选择 ?选择的需要性 ?杂种细胞选择方式 1、对于在形态上易区分的原生质体及杂种细胞,可 在低密度下培育,然后用机械方式将杂种细胞分手 出来。 2、荧光染料标识表记标帜选择 3、互补选择法 操纵两亲来源根基生质体对培育基成分、抗代谢物或温度等 的敏感性具有着的天然的互补性差别,以及隐性突变形成的 遗传互补来筛选杂种细胞。 互补选择法 ?操纵分歧乡来源根基生质体在遗传上、抗性上和心理上 的互补进行选择: ?白化(aaBB)+白化(AAbb)?绿色(AaBb) ?养分缺陷( aaBB )+养分缺陷( AAbb ) ?自养( AaBb ) ?抗性( aaBB )+抗性( AAbb ) ?双抗( AaBb ) ?对培育基成分和抗代谢物互补 ?对光照敏感性互补 叶绿体缺失突变体 光敏突变体 融合,高光强 下培育 只要杂种细胞 构成绿色的对 光不敏感的细 胞团 矮牵牛两个种的原生质体对培育基成分及 放线菌素D(抗代谢物)的敏感性具有差别 原生质体类型 在MS培育基上能 否构成愈伤组织 不克不及 能 对放线菌素D 敏感性 不敏感 敏感 甲种 乙种 杂种细胞 能 不敏感 六、杂种植株判定 (一)判定的目标 确认体细胞杂种的杂种性;杂种所具有的的遗传构成及性状变异环境。 (二)判定方式 1、形态判定 (1)在种间体细胞杂种中,杂种表示或多或少居于融合亲本 之间,而在属间的体细胞杂种中,表示型更多的是方向于亲本 之一。 (2)在判定中留意情况前提及非整倍变异的影响。 2、细胞学阐发 3、酶谱阐发:好像工酶、淀粉酶、天冬氨酸氨基转移酶等 4、DNA内切图谱阐发 七、细胞质杂种 ?细胞质杂种:由两种来历分歧的核外遗传成分(细胞器) 与一个特定的核基因组(双亲之一)连系构成的细胞杂种。 (一)细胞质杂种的获得路子 1、八达国际真人娱乐官网通过原生质体融合和培育获得 2、诱导原生质体摄入细胞器获得胞质杂种 (二)胞质杂种的使用 在种内或种间转移细胞质遗传物质节制的性状。如雄性不育。 (三)细胞质杂种的判定 1、表型判定 2、生化判定和核酸(核外)酶切阐发 如对1,5二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPcase)亚基多肽图谱 的阐发(该酶小亚基多肽有核DNA编码,大亚基有叶绿体 DNA编码) 在原生质体可以或许完全融合环境下,胞质杂种可通过以下路子 发生: (1)一个一般的原生质体与一个去核的原生质体融合; (2)一个一般的原生质体和一个核失活的原生质体融合; (3)在异核体构成之后二个核中有一个消逝; (4)在较晚的期间发生染色体选择性的消弭。 第六节 原生质体的使用价值 一、在动物遗传改良上的使用 1、扩大物种间遗传物质交换的范畴,缔造新种。 2、转移优秀性状,改良现有品种 3、作为遗传转化的受体使用于基因工程。 4、操纵原生质体无性系变异选育新种质。 二、根本理论研究上的使用 1、在动物心理学研究中的使用:如细胞壁再生、内吞感化、 气孔心理、离子接收与运输等; 2、在基因表达表达调控研究中的使用; 3、在动物病毒分子生物学研究中的使用。 由 普 通 小 麦 和 高 冰 草 经 体 细 胞 杂 交 获 得 的 第 三 代 植 株

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